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核酸检测实验室及其照明

4月26日,国家卫健委举办全国视频会议,明确提出“所有县区级以上疾控机构、二级以上综合医院要抓紧进行改造,在短时间内形成核酸检测能力

疫情当前,核酸检测能力成为抗疫的重要支持手段,各地的公立机构检测能力和独立医学实验室尚不能全部满足需求,因此急需扩建核酸检测实验室,提升医学检测能力。本文从实验室建设和运营的角度,介绍了核酸检测实验室的基础知识、基本概念及其对专业照明的要求。

核酸检测实验室的建设

一组完整的PCR实验,通常包括试剂配制、样品处理、核酸扩增和产物分析4个实验过程。对应这四个过程,就要配置相应的工作区域,标准的PCR实验区应包括试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区、各区配套的缓冲区及公共走廊。

■ PCR实验室整体平面布局

图1是典型的PCR实验室平面布局图,整个区域有一个公用走廊,每个独立实验区设有专门的缓冲区。通过压差控制,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并且降低扩增产物对人员和环境的污染。

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图1、典型的PCR实验室平面图

■ 试剂准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。

试剂准备区配备有2~8°C冰箱和-80°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。

房间的面积宜控制在15㎡~20㎡。本区的压力梯度要求为:相对正压状态,以防止外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染。

■ 标本制备区

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

标本制备区配备有2~8°C冰箱和-20°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。在标本制备区,还需要配备生物安全柜,用于进行提取核酸的操作。

为避免提取的核酸在柜内反复循环,造成标本之间的交叉污染,出现假阳性结果,该区域配备的生物安全柜必须是B2型的。生物安全柜工作区垂直气流全部来自实验室,排风经过高效过滤器过滤后直接排至室外,不允许回到安全柜和实验室中。

根据经验,如果实验室内配备生物安全柜,每配备一台,实验室的面积增加10㎡;标本制备区的面积宜在25㎡~30㎡之间。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。

■ 扩增室

该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。

在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。

扩增室主要配备PCR实验室的核心仪器PCR仪,本文实例中使用了ABI7500和ABI9700两种PCR仪。

在实验室建造过程中,需要给PCR仪配备专门的UPS电源,以保证其正常工作。该区面积控制在15㎡~20㎡。

本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。建议采用5~10Pa压差,在控制上比较容易实现。

■ 产物分析区

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。

在室内配备通风橱,保证房间内的相对负压,空气从室外流向室内。该区面积控制在15m²~20m²。

本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。建议采用5~10Pa压差,在控制上比较容易实现。

 

核酸检测实验室的运行管理

核酸检测实验室的良好运行,首先要建立起良好的质量管理体系,按照作业规范和实验室管理文件来操作,同时还要维持良好的洁净环境,并从生物安全的角度,维持好实验室不同区域的压差管理。污染预防与控制,更是检测实验室运行中的重要一环。

■ 实验室的质量管理体系

实验室的良好运行首先要建立起良好的质量管理体系。

  • 根据实验室的具体情况编写质量体系文件,《质量手册》、《程序文件》、《作业指导书》,并保证管理体系运行有效。
  • 管理体系的特点是应有明确的目的、规范的管理、有效的制约、高效的机制、能自我发展的整体。
  • 建立完善的SOP文件,对完成各项质量活动的方法作出规定,每个SOP都应对一个或一组相互关系的活动进行描述。
  • 每个SOP文件应说明该项质量各环节的输入、转换和输出所需的文件、物资、人员、记录以及它们与有关活动的接口关系。
  • 明确每个环节转换过程中各项因素的要求,即由谁做、做什么、做到什么程序、达到什么要求,如何控制、形成什么记录和报告,以及相应的审批手续。
  • 规定在质量活动中需要注意的例外或特殊情况的纠正措施。SOP应简练、明确和易懂并且工作人员熟练掌握和严格遵守。

■ 实验室的洁净和压差管理

核酸检测实验室除了按照生物医学实验室的管理要求进行洁净控制以外,还要特别注意压差管理。

根据压力梯度的要求,试剂配制室和样品处理室为相对正压,扩增室和产物分析室为相对负压,要求正压的区域和要求负压的区域的缓冲室内的压力设计大不相同。

正压缓冲室符合一般正压洁净室的缓冲原则,主要是防止室外环境空气中的气溶胶进入室内。正压缓冲室的布置如图2所示。

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图2、正压缓冲区的示意图

负压缓冲室则是要求缓冲室对核酸扩增室及产物分析区保持正压,对缓冲室外也保持正压(主要是满足室内净化需要,如室内无洁净要求,此处可以为0压)。负压缓冲室的布置如图3所示。

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图3、负压缓冲区的示意图

■  实验室污染的预防与控制

实验室运行的核心问题是如何避免污染。在实际运行中的常见污染包括扩增产物的污染、天然基因组DNA的污染、试剂的污染以及标本间的污染,要对此进行预防与控制。

  • 区域的划分,各个实验区域要进行严格的划分,并有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。
  • 合理的设置,合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统,严格的气流压力控制,以保证不同的实验区内不同的压力要求。
  • 规范的操作,临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训,在实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。清洁工作及时、正确。实验工作结束后,必须立即对本区进行清洁。
  • 严格的管理,控制进出实验室的人员,并赋予不同的权限。在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服(如不同颜色),当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域,尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等。

 

核酸检测实验室的照明

生物医学实验室的照明有专业的要求,不仅需要良好的照明设计和施工,对光源和灯具也有专门的要求。

■ 照明设计和施工的要求

根据建筑照明规范和实验室管理办法,检测实验室要提供良好的照度水平、均匀度、显色性和眩光控制。

表1 生物实验室照明基本要求

空间名称

最低平均照度 (lx)

照度均匀度

一般显色指数Ra

一般眩光值

工作间

300

0.7

80

19

缓冲间

200

0.6

80

19

走廊

150

0.6

80

19

■ 照明灯具和光源的要求

基于检测条件、污染控制和洁净度维持的要求,要提供满足照明环境的灯具和光源,主要包括以下几方面的要求:

物理防尘:满足洁净室灯具的处理要求,表面不积尘,不产生静电吸附

生物防菌:表面材料进行生物灭活处理,落菌和病毒在灯具上不能繁殖

易维护性:灯具吸顶安装,不阻碍气流,灯具表面光滑,并且密闭防水

高可靠性:采用长寿命光源,减少光源更换和维护频次,降低运行成本

■ 卓辉生物洁净室专用无菌灯

卓辉光电股份组织开发的无菌型洁净室灯具是国内首款专门针对生物安全实验室的照明灯具,采用日本固体照明研究所提供的专业LED光源,表面采用特殊纳米材料处理,不仅防尘、防水、防腐、防菌,更把灯具的平均无故障工作时间提高到50000小时以上,成为本次核酸检测实验室建设的首选照明产品。

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图4、生物洁净室专用灯具